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本试剂盒用于从革兰氏阳性（G+）细菌中小量制备质粒DNA。本制品是经过精心改良后的碱变性法质粒DNA纯化试剂盒，其原理是菌体经溶菌酶破壁，将破壁后的菌体用碱使基因组DNA和质粒DNA全部变性，经酸中和后的质粒DNA可以快速复性，基因组DNA不能快速复性，通过离心可有效去除基因组DNA。除去基因组DNA后的含质粒DNA的上清用离心吸附柱吸附质粒DNA，洗去杂质，即可得到纯化的质粒DNA。

• 简单快捷，整个实验在40分钟左右完成。
  
• 不需要预平衡离心吸附柱。
  
• 通用洗柱液即开即用，不需要用户额外加乙醇。
  
• 溶液B中有蓝色染料，便于目测非常关键的碱变性和中和反应两步的溶液混匀状况，保证实验效果。
  
• 产量高，一次可以处理1～4mL过夜培养的G+菌液，每毫升过夜培养的G+细菌可以提取到2～5μg/mL，纯化后质粒DNA的浓度取决于质粒的拷贝数。
  
• 纯度高，采用本试剂盒提取的质粒OD比值在1.8～2.0之间，可以直接用于酶切、转化、测序及PCR等。

• 从筛选平板上挑取单菌落至含抗生素的培养基中，37℃震荡培养12～16小时（摇床转速200-300）。
  
  • 建议使用LB培养基，营养更丰富的培养基会使菌体浓度过高，超过纯化系统的处理能力而降低质粒DNA的质量。
    
  • 延长培养时间会因细胞死亡、裂解而造成质粒DNA浓度降低。
• 用1.5mL离心管收集1～4mL过夜培养饱和菌液，室温12000rpm离心1分钟，弃上清，再短暂离心，吸弃残留液体。
  
• 第一次使用本试剂盒时，先将本试剂盒提供的全部RNase A溶液加入到革兰氏阳性细菌质粒DNA纯化溶液A（简称溶液A，下同）中，摇匀后再取用，未用完的溶液A放4℃保存。
  
• 加入250μL溶液A到第2步得到的细菌沉淀中，用枪头充分吹打使菌体重悬。
  
  • 细胞未充分悬浮会影响后续碱变性，可以使用漩涡振荡器混匀或使用枪头吸头吹打沉淀至完全混匀。
• 加入大约5mg溶菌酶干粉到细菌悬液中（用0.1mg精度的分析天平称量），轻柔颠倒混匀后室温放置10分钟破裂细胞壁。
  
• 加入250μL革兰氏阳性细菌质粒DNA纯化溶液B（下面简称溶液B），温和颠倒4～6次混匀，蓝色将变得均匀并且溶液将变得粘稠。
  
  • 如果溶液B在低温放置产生沉淀，须37℃加热溶解后冷却到室温方可使用
    
  • 千万不要剧烈振荡，否则基因组DNA断裂产生的片段非常容易污染质粒DNA。溶液B用后需要将盖拧紧存放，否则空气中的二氧化碳会进入溶液，形成碳酸，中和溶液B中的碱，降低其效率。如果溶液B颜色不是蓝色，则表示变质，应该弃之不用并且跟厂家联系。
• 冰上放置不超过5分钟。
  
  • 冰上放置不要超过5分钟，否则质粒DNA会有碱损伤。
• 加入350μL冰上预冷的革兰氏阳性细菌质粒DNA纯化溶液C（下面简称溶液C），温和反复颠倒4～6次，溶液将变成无色，将有白色絮状沉淀产生。
  
• 冰上放置至少5分钟让质粒DNA复性。不能短于5分钟，一般10分钟。
  
• 12000rpm离心3分钟，小心将上清液转移到离心吸附柱中。
  
  • 由于此时的溶液比重较大，部分絮状物悬浮在上清液中属正常现象，吸取上清时避开这些悬浮物即可。如果此步的离心在4℃进行，可减轻沉淀物漂浮。
• 静置2分钟以让质粒DNA与离心吸附柱充分结合。
  
• 室温12000rpm离心1分钟，弃收集管中的废液。
  
• 加入500μL的通用洗柱液到离心吸附柱中，室温12000rpm离心1分钟，弃收集管中废液。
  
  • 通用洗柱液中含乙醇，每次用后需要将盖拧紧存放，否则乙醇会挥发。
• 重复上步1次。
  
• 室温12000rpm离心1分钟，甩干残留液体。
  
  • 此步不能省略，否则残留乙醇会影响DNA的后续使用，比如残留乙醇使DNA溶液在电泳上样时不能沉淀到加样孔中。
• 将离心吸附柱置于一个新的1.5mL塑料离心管中，加入30～100μL 65～80℃预热的DNA洗脱液，室温放置2分钟。
  
• 室温12000rpm离心1分钟，离心管底溶液即质粒DNA溶液。